style="width:4.84665in;height:0.64658in" /> (1) 本文是学习GB-T 17818-2010 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了饲料中维生素 D₃ 的高效液相色谱法测定。
本标准第一法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素
D₃ 的测
定，定量限为12.5μg/kg(500 IU/kg)。
本标准第二法适用于维生素预混合饲料中维生素D₃ 的测定，定量限为125
mg/kg(5×10⁵ IU/kg)。
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
用碱溶液皂化试样，乙醚提取维生素D₃ ,
蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇并将部分溶液注入高效液相色
谱反相净化柱，收集含维生素 D3
淋洗液，蒸发至干，溶解于适当溶剂中，注入高效液相色谱分析柱，在
264 nm处测定，外标法计算维生素 D₃ 含量。
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682
中三级用水规定，色谱用水符合
GB/T 6682 中一级用水规定，溶液按照GB/T603 配制。
3.2.1 无水乙醚(不含过氧化物)
3.2.1.1 过氧化物检查方法：用5 mL 乙 醚 加 1 mL
碘化钾溶液(3 . 2 . 9),振摇1 min, 如 有 过 氧 化 物 则
放出游离碘，水层呈黄色，或加淀粉指示液(3.2.10),水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。
3.2.1.2
去除过氧化物的方法：乙醚用硫代硫酸钠溶液(3.2.11)振摇，静置，分取乙醚层，再用水振摇，
洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。
3.2.4 1,4-二氧六环。
3.2.6 2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)。
3.2.8 氮气(纯度99.9%)。
3.2.9 碘化钾溶液：100 g/L。
GB/T 17818—2010
3.2.10 淀粉指示液：5 g/L (临用现配)。
3.2.11 硫代硫酸钠溶液：50 g/L。
3.2.12 氢氧化钾溶液：500 g/L。
3.2.13 L- 抗坏血酸乙醇溶液：5 g/L, 取0 . 5 gL-
抗坏血酸结晶纯品溶解于4 mL 温热的水中，用无水 乙醇(3.2.2)稀释至100 mL,
临用前配制。
3.2.14 酚酞指示剂：10 g/L。
3.2.15 氯化钠溶液：100 g/L。
3.2.16 维生素 D₃ 标准品：维生素 D₃ 含量≥99.0%。
3.2.17 维生素 D₃ 标准贮备液：称取50 mg 维生素 D₃
(胆钙化醇)标准品(3.2.16)(精确至0.00001 g) 于 5 0 mL
棕色容量瓶中，用正己烷溶解并稀释至刻度，混匀，4℃保存。该贮备液浓度为1.0
mg/mL。
3.2.18 维生素 D。标准工作液：准确吸取维生素 D₃
标准贮备液(3.2.17),用正己烷(3.2.3)按1:100
比例稀释，若用反相色谱测定，将1.0 mL 维生素 D₃ 标准贮备液置入10 mL
棕色容量瓶中，用氮气吹
干，用甲醇(3.2.5)稀释至刻度，混匀，再按比例稀释，该标准工作液浓度为10μg/mL。
3.3.1 分析天平，感量0.001 g。
3.3.2 分析天平，感量0.0001 g。
3.3.3 分析天平，感量0.00001 g。
3.3.4 圆底烧瓶，带回流冷凝器。
3.3.5 恒温水浴或电热套。
3.3.8 高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。
按照GB/T 14699.1的规定执行。
按照GB/T 20195制备试样，磨碎，全部通过0.28 mm
孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存
备用。
3.6.1.1 皂化
称取试样，配合饲料10 g～20g, 浓缩饲料10 g,精确至0.001
g,维生素预混合饲料或复合预混合
饲料1 g～5g, 精确至0 .0001 g,置入250 mL 圆底烧瓶中，加50 mL～60
mLL-抗坏血酸乙醇溶液
(3.2.13),使试样完全分散、浸湿，加10 mL
氢氧化钾溶液(3.2.12),混合均匀，置于沸水浴上回流 30
min,不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5 mL
无水乙醇(3.2.2)、5 mL 水自冷凝管
顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40℃。
3.6.1.2 提取
定量转移全部皂化液于盛有100 mL 无水乙醚(3.2.1)的500 mL
分液漏斗中，用30 mL～50 mL
水分2次～3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖、放气、随后混合，激烈振荡2
min,静置分层。转移水 相于第二个分液漏斗中，分次用100 mL、60mL
乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用氯 化钠溶液(3.2.15)100
mL 洗涤一次，再用水每次100 mL 洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋
摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠(3.2.7)脱水，转移到250 mL
棕色容量瓶中，加100 mg
BHT(3.2.6) 使之溶解，用乙醚定容至刻度(V)。
以上操作均在避光通风柜内进行。
GB/T 17818—2010
3.6.1.3 浓 缩
从乙醚提取液(V₁) 中分取一定体积(V₂)
(依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)置于旋
转蒸发器烧瓶中，在部分真空，水浴温度50℃的条件下蒸发至干，或用氮气吹干。残渣用正已烷(3.2.3)
溶解(需净化时用甲醇溶解，按3.6.1.4进行),并稀释至10 mL(V₃)
使其获得的溶液中每毫升含维生
素D₃2μg～10μg(80IU～400IU), 离心或通过0.45μm 过滤膜过滤，收集清液移入2
mL 小试管，用
于高效液相色谱仪分析。以上操作均在避光通风柜内进行。
3.6.1.4 高效液相色谱净化柱净化
用 5 mL 甲醇(3.2.5)溶解圆底烧瓶中的残渣，向高效液相色谱净化柱中注射0.5
mL 甲醇溶液(按 3.6.2. 1所述色谱条件，以维生素 D₃
标准甲醇溶液流出时间±0 . 5 min) 收集含维生素 D₃ 的 馏 分 于
50 mL 小容量瓶中，蒸发至干(或用氮气吹干),溶解于正已烷中。
所测样品的维生素 D。标示量在每千克超过10000 IU
范围时，可以不使用高效液相色谱净化柱，
直接用分析柱分析。
3.6.2.1 高效液相色谱净化条件
色谱净化柱：Lichrosorb RP-8,长25 cm, 内径10 mm, 粒 度 1 0 μm。
流动相：甲醇十水(90+10)。
流速：2.0 mL/min。
温度：室温。
检测波长：264 nm。
3.6.2.2 高效液相色谱分析条件
3.6.2.2.1 正相色谱
色谱柱：硅胶 Si60, 长 1 2 5 mm, 内径4 . 6 mm, 粒 度 5 μm
(或性能类似的分析柱)。
流动相：正己烷+1,4二氧六环(93+7)。
流速：1.0 mL/min。
温度：室温。
进样量：20μL。
检测波长：264 nm。
3.6.2.2.2 反相色谱
色谱柱：Ci₈ 型柱，长125 mm, 内径4 .6 mm, 粒 度 5 μm
(或性能类似的分析柱)。
流动相：甲醇+水(95+5)。
流速：1.0 mL/min。
温度：室温。
进样量：20 μL。
检测波长：264 nm。
3.6.2.3 定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，为准确测量按要求对分析柱进行系统适应性试验，使
维生素 D。与维生素 D₃ 原或其他峰之间有较好分离度，其 R≥1.5 。
向色谱柱注入相应的维生素 D₃ 标
准工作液(3.2. 18)和试样溶液(3.6.
1),得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。
3.6.2.4 结果计算
3.6.2.4.1 试样中维生素 D₃ 的含量，以质量分数 X;
计，数值以国际单位每千克(IU/kg) 或毫克每千
克(mg/kg) 表示，按式(1)计算：
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GB/T 17818—2010
式中：
P₁— 试样溶液(3.6.1)峰面积值；
V₁ 提取液的总体积，单位为毫升(mL);
V₃— 试样溶液最终体积，单位为毫升(mL);
p— 维生素 D₃ 标准工作液(3.2.18)浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
P₂— 维生素 D₃ 标准工作液(3.2.18)峰面积值；
m₁—— 试样质量，单位为克(g);
V₂— 从提取液(V₁) 中分取的溶液体积，单位为毫升(mL);
fi— 转换系数，1国际单位(IU) 维生素 D₃ 相当于0.025μg 胆钙化醇。
注：维生素
D。对照品与试样同样皂化处理后，所得标准溶液注入高效液相色谱分析柱以维生素
D₃ 峰面积计算时
可不乘1.25。
3.6.2.4.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。
3.6.2.5 重复性
同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差见表1。
表 1 相对偏差
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维生素预混合饲料中的维生素 D₃
用甲醇溶液提取，试液注入高效液相色谱柱，在264 nm 处测定，
外标法计算维生素 D₃ 含量。
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682
中三级用水规定，色谱用水符合
GB/T 6682 中一级用水规定。
4.2.1 维生素 D₃ 标准品：维生素D₃ 含量≥99.0%。
4.2.2 维生素 D₃ 标准贮备液：称取维生素 D₃ 标准品(4.2.1)100 mg
(精确至0.00001 g),于100 mL
棕色容量瓶中，用甲醇(3.2.5)溶解并稀释至刻度，混匀，4℃保存。该贮备液浓度为1.0
mg/mL。
4.2.3 维生素 D₃ 标准工作液：准确吸取维生素 D₃ 标准贮备液(4.2.2)1.0
mL 于100 mL 棕色容量瓶
中，用甲醇(3.2.5)稀释至刻度，混匀，配制工作液浓度为10μg/mL。
同3.4。
同3.5。
称取试样1 g,精确至0.0001 g,置于100 mL 的棕色容量瓶中，加入约80 mL
的甲醇，瓶塞不要拧
GB/T 17818—2010
紧，于65℃超声波水浴中超声提取30 min,
冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，将溶液过
0.45μm 滤膜，进样测定，使待测样品维生素 D₃
的进样浓度与标准溶液浓度接近。
4.6.2.1 色谱条件
色谱柱：Ci₈ 型柱，长150 mm, 内径4.6 mm, 粒度5μm(或性能类似的分析柱)。
流动相：甲醇十水(98+2)。
流速：1.0 mL/min。
温度：室温。
进样量：20 μL。
检测波长：264 nm。
4.6.2.2 定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素 D₃
标准工作液(4.2.3)
和试样溶液(4.6.1),得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。维生素 D₃
标准色谱图参见图 A. 1。
4.6.2.3 结果计算
4.6.2.3.1 试样中维生素 D₃ 的含量，以质量分数 X:
计，数值以国际单位每千克(IU/kg) 或毫克每千
克(mg/kg) 表示，按式(2)计算：
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…………
……………
(2)
式中：
P₃— 试样溶液(4.6.1)峰面积值；
V——试样溶液(4.6.1)的总稀释体积，单位为毫升(mL);
p₂— 维生素D₃ 标准工作液(4.2.3)浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
P,— 维生素 D₃ 标准工作液(4.2.3)峰面积值；
m₂—— 试样质量，单位为克(g);
f₂— 转换系数，1国际单位(IU) 维生素D₃ 相当于0.025μg 胆钙化醇；
1.07——提取时生成预维生素D₃ 的校正因子。
注：维生素D₃
标准品与试样同样处理后，所得标准溶液注入高效液相色谱分析柱以维生素 D₃
峰面积计算时可不
乘1.07。
4.6.2.3.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。
4.6.2.4 重复性
同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于10%。
style="width:2.82665in" />
GB/T 17818—2010
(资料性附录)
维生素 D₃ 标准色谱图
style="width:11.73329in;height:4.34016in" />
图 A.1 维生素 D₃ 标准色谱图
style="width:4.16005in;height:1.85988in" />
中 华 人 民 共 和 国
国 家 标 准
饲料中维生素 D₃ 的测定
高效液相色谱法
GB/T 17818—2010
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开本880×1230 1/16 印张0 . 75 字数12 千字
2010年11月第一版 2010年11月第一次印刷
兴
书号：155066 ·1-40642
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